蛙携带虹彩病毒的分子流行病学研究

 基础医学论文     |     by 艾维学术     |      2018-08-10 15:53

50年來,全球范围内多种两栖动物种群显著衰退,一些种类已经灭绝,部分物种濒危,原因包括气候变化、栖息地减少、环境污染以及疾病传播等[12]。其中蛙壶菌(Batrachochytriumdendrobatidis)和虹彩病毒(Iridoviruses)是引起两栖类种群数量下降的主要病原因素[3-5]。中国部分蛙种的资源量也因环境变化以及人为捕捉等因素急剧减少。如虎纹蛙(Hoplobatrachusruguosus)、林蛙(Ranadybowskii)、棘胸蛙(Quasipaaspinosa)等种类因肉味鲜美、营养丰富遭到过度捕捉,导致这些蛙类野生资源量急剧减少[67]。近年来,为保护自然资源及满足市场需求,人们开展了多个蛙种的驯养及人工增养殖[8-10]。但人工增养殖的模式对野生蛙类资源以及当地自然生态环境的影响缺乏系统的评估,尤其是人工增养殖中虹彩病毒病的暴发对野生资源的影响缺乏深入研究。

虹彩病毒无囊膜,对环境适应力较强,可在土壤和水体中存活长达几个月而保持感染性[11]。为适应蛙的特殊生活习性,养殖场多位于较偏僻的山林地区,与周边环境存在许多交互作用。当蛙养殖场暴发虹彩病毒病后,养殖用水的不规范处理、蛙的逃逸以及带毒蛙的商业流动等对当地野生蛙类资源的影响亟需评估。先前,湖北省宜昌市某养殖场发生棘胸蛙的暴发性死亡,经鉴定为蛙病毒的感染所致[12],但其病毒来源以及蛙携带病毒的本底等基础问题尚未知。为此,本研究利用建立的蛙病毒多重检测方法[13],对不同来源的养殖和野生蛙类携带虹彩病毒进行初步调查,并进行病毒分型研究,以期为优化人工增养殖的蛙类资源保护模式提供参考。

1材料与方法

1.1样品采集

样品详细采样情况见表1。采集的蛙经麻醉后取脾或肾用于后续的检测。

1.2样品DNA提取与筛查

组织DNA的提取采用康为世纪通用型柱式基因组提取试剂盒,取不超过0.1g组织,按试剂盒说明书进行,组织DNA50μL的三蒸馏水洗脱,-20℃保存。

以优化的三重荧光PCR方法筛查[13]。优化的三重荧光PCR反应体系(25μL)如下:5μLDNA模板,10×recreationbuffer2.5μL25mmol/LMgCl23μL10mmol/LdNTP0.5μL,通用正向引物(20μmol/L1μL,通用反向引物(20μmol/L1μL,探针120μmol/L0.5μL,探针220μmol/L0.5μL,探针320μmol/L0.5μLTaqDNA聚合酶(5U/μL0.5μL,用去离子水补足至总体积25μL。采用RocheLightCycler480Ⅱ荧光PCR检测仪:第一阶段:953min;第二阶段:9515s5415s6030s40个循环;60℃延伸时收集荧光。扩增结果以在相应的检测通道呈典型的“S”型扩增曲线及Ct值判定。

1.3基因扩增与克隆

以蛙病毒保守引物RGVP1/P25-GACTTGGC

CACTTATGAC-3/5-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3’)擴增“1.2”中准备的部分样品DNA,扩增循环条件为9530s5045s7230s35个循环,预期扩增片段为531bp,预期目的条带经胶回收后直接测序验证。

NCBI登陆的蛙病毒主要结构蛋白(majorcapsidproteinMCP)序列设计引物MCPF1/R15-ATGTCTTCTGTAACCGGTTCAG-3/5-TTACAAGA

TTGGGAATCCCATCG-3’),用于扩增蛙病毒的MCP全长,扩增循环条件为9530s5045s7290s30个循环,预期扩增片段为1392bp。扩增产物经胶回收后连接至T-easy载体,每个基因选择3个阳性克隆子测序。

1.4序列分析

DNAstar进行常规的序列拼接与编辑,序列比对以Clustal2.0软件进行,聚类分析以MEGA6.0进行,以邻接法构建进化树,选择成对缺失模式,以bootstrip值进行验证,进化树以Treeview进行编辑。

2结果与分析

2.1样品筛查结果

先前建立的三重荧光定量PCR可检测不同种类的蛙病毒,其中探针1可检测包含蛙病毒3型(Frogvirus3FV3)、饰纹汀蛙虹彩病毒(BoheliridovirusBIV)、流行性造血器官坏死症病毒(EpizooticHaematopoieticNecrosisVirusEHNV)、欧洲鮰鱼病毒(EuropeancatfishiridovirusECV)、欧鲶病毒(EuropeansheetfishiridovirusESV)、中华鳖虹彩病毒(Soft-shelledTurtleiridovirusSTIV)、大鲵虹彩病毒(AndriasdavidiamusiridovirusADIV)、沼泽绿牛蛙虹彩病毒(RanagryliovirusRGV)、虎纹蛙病毒(TigerfrogvirusTFV)等的蛙病毒,探针2可检测大口黑鲈虹彩病毒(LargemouthbassranavirusLMBV)、裂唇鱼病毒(DoctorfishvirusDFV)和孔雀鱼病毒(GuppyfishiridovirusGV6),探针3可检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(SingaporegrouperiridovirusSGIV[13]。样品筛查结果(表2)显示,探针1检测的阳性率为8.90%,从养殖的219份蛙样品中检出10份阳性,平均Ct值为26.45,最小Ct值为20.03。从野外捕捉的107份蛙样品中检出19份阳性,平均Ct值为28.18,最小Ct值为22.97。从蛙种类来看,牛蛙和黑斑蛙带毒率较低,而野外捕捉的斑腿树蛙带毒率较高。探针23均未检出阳性。

2.2不同来源蛙携带病毒的比较

因探针1可检测多种蛙病毒,为确定检测到的蛙病毒属于哪一种,进一步以蛙病毒MCP保守引物进行扩增,扩增片段为531bp,并进行测序。Blast比对结果(图1)显示,获得的MCP部分序列高度保守,同Ranagryliovirus9807高度保守,仅养殖来源的棘胸蛙(QSV46)同其他序列相差一个碱基,并导致一个氨基酸的差异。

为比较上述不同来源的蛙病毒的差异,设计引物扩增养殖的棘胸蛙来源(QSV46)与斑腿树蛙(PMV69)携带病毒的MCP全长。如图1所示,QSV46PMV69的核苷酸序列仅相差4个碱基,并导致4个氨基酸的差异。同蛙病毒属的代表种FV3编码的MCP比较,QSV46FV3相差5个氨基酸,PMV69FV3仅相差2个氨基酸。值得指出的是,PMV69的序列同本实验室先前从某养殖场获得的QSV01MCP全长序列完全一致[12],但两者种类不同、来源不一致、采样地点的距离超过400km。同中国其他来源的蛙病毒比较显示,不同蛙类携带的FV3FV3样病毒,如RGVTFV同源性都非常高。

GenBank获得虹彩病毒科各代表种的MCP全长序列,与本研究中获得的MCP全长进行比对,并构建进化树(图2),由图2可见,QSV01QSV46以及PMV69FV3STIV聚为一支,均为蛙病毒属的成员。

ClustalX2比对虹彩病毒科各代表种编码的MCP氨基酸序列,以MEGA6构建进化树。参考序列如下:STIVEU627010)、RGVJQ654586)、FV3AY548484)、TFVAF389451)、ATVAY150217)、GSIVAET51835.1)、ISKNVAF371960)、RBIVAY532606)、OSGIVAY894343)、LCDV-CAY380826)、LCDV-1L63545)、IIV6NP149737.1)、IIV3DQ643392);QSV01QSV46PMV69为本研究涉及;GSIV-HN为华中农业大学水生动物病毒实验室于2012年从河南发病大鲵分离获得。

3小结与讨论

近年来,气候变化与人类活动是导致蛙类种群数量下降的主要原因,但蛙壶菌和蛙病毒等病原生物的感染也是导致蛙种群数量降低的重要原因[1-5]。据报道,目前蛙病毒感染的两栖类种类多达74种,其中主要为无尾目(Anura)蛙科(Ranidae)的成員[4]。蛙病毒可能引起蛙类的致死性感染,如Green[14]分析了1996-2001年间美国两栖类死亡事件,其中57%的两栖类死亡事件与蛙病毒有关。张奇亚等[15]、王晓红等[16]、刘晓东等[17]分别从沼泽绿牛蛙(Ranagrylio)、虎纹蛙(Ranatigrinarugulosa)、牛蛙(Ranacatesbeiana)等养殖蛙上分离到蛙病毒,李莉娟等[12]首次从人工养殖的患病棘胸蛙中分离到蛙病毒QSV01。蛙病毒除了致死性感染外,也能形成无临床症状的携带状态。如Xu[18]对黑龙江省的东北林蛙携带蛙病毒的初步调查显示东北林蛙成体的带毒率为5%9/180),夏季蝌蚪的平均带毒率高达42.5%51/120)。本研究也显示从养殖或野外捕捉的蛙携带病毒的平均比例为8.90%29/326)。野生蛙类的带毒状态对蛙类种群的潜在影响尚缺乏系统评估。存在因栖息地减少、食物缺乏以及环境剧变等强应激下,蛙病毒从携带感染(或潜伏感染)转化为急性感染、引起蛙的死亡的潜在威胁。亟需利用生态学与流行病学等多学科的研究手段,在生态学的大尺度上评估蛙携带病毒对其种群的影响。

综合已有的研究,野生蛙携带病毒的比率受调查种类、栖息环境以及采样季节的影响,波动幅度非常大(0%80%[4]。在本研究中,不同来源与种类的野生蛙带毒比率差别也非常大,其中斑腿树蛙的带毒率最高,黑斑蛙带毒率最低,仅2%,可能与不同蛙种对蛙病毒的敏感性有差异相关。Hoverman[19]的研究已证实不同蛙类对蛙病毒的敏感性存在差异,他们在调查北美的19个蛙种中,木蛙(Lithobatessylvaticus)和穴蛙(L.capito)的敏感性最高。

通过比较不同蛙携带的蛙病毒的分子序列,显示不同来源的蛙病毒高度保守,缺乏明显的宿主与地域特异性。如从患病沼泽绿牛蛙中分离到蛙病毒(RGV9506RGV9807RGV9808)、从牛蛙中分离的蛙病毒(FJ049)、从虎纹蛙中分离的蛙病毒(TFV)以及从棘胸蛙分离的蛙病毒株(QSV01MV69)都高度相似,氨基酸一致率在99%以上,其编码的MCP仅相差05个氨基酸(图1)。值得指出的是,QSV01来源于患病棘胸蛙,PMV69来源于野外捕捉的斑腿树蛙,两个样本来自不同地域,但两者编码的MCP完全一致,提示蛙病毒没有严格的宿主特异性,很可能存在跨种间传播的现象,为蛙类野生资源保护提出了更为严峻的现实难题。根据《中华人民共和国野生动物保护法》等规定,国家鼓励驯养繁殖野生动物。但人工驯养与增养殖的野生动物保护策略,尤其是蛙类、珍稀鱼类等群体生物,随着养殖密度的提高、养殖环境的应激增强等因素极大地增加了疾病传播的几率。同时,这些养殖场多同自然环境交互较密切,养殖废水的消毒不彻底、养殖对象的逃逸、带毒动物的商业化流通甚至放流等因素很可能对野生种质资源造成负面影响。因此在野生动物人工驯养繁殖体系中建立病害监测、引入系统的疫病防控策略显得尤为重要和迫切。

艾维学术(http://www.antve.com)是一家专业代写论文的垂直网站,专为广大师生提供论文代写代写硕士论文、代写论文、代写毕业论文,主营硕士论文代写及论文发表服务。欢迎广大师生一起讨论论文写作研究!


特别声明:本文转载仅仅是出于传播信息的需要,并不意味着代表艾维学术的观点,作者如果不希望被转载,请与我们接洽。如需在本站转载须保留本网站注明的“来源”。本文来源地址:http://www.antve.com/xueshufanwen/yixuelunwen/jichuyixue/17691.html


相关论文推荐:


公共卫生突发事件的流行病学调查应急处理对策 高血压流行病学特点及老年高血压防治效果观察
某精神科病区暴发疥疮感染的流行病学调查与控制对策分析 骨折后须长期卧床患者生活质量现状调查与护理措施制定
温经散寒、祛瘀止痛法治疗寒凝血瘀型原发性痛经80例 《手术患者皮肤管理记录单》在术后皮肤康复护理中的应用
有限元模型下颅脑温度的特性分析 如何利用颅脑简化分层传热模型进行温度预测
医学检验技术专业医用化学形成性评价的探索 浅谈医学与翻译伦理


上一篇:高血压流行病学特点及老年高血压防治效果观察
下一篇:公共卫生突发事件的流行病学调查应急处理对策